Mitochrondriale Heteroplasmie

Forensiche Genetik (DNA) - von Frau Dr. biol. hum. Rachel Klein

Als mitochondriale Heteroplasmie wird das Vorkommen von mehr als einem Typ mitochondrialer DNA innerhalb eines Individuums bezeichnet. Man unterscheidet Sequenz- und Längenheteroplasmie. Eine Längenheteroplasmie tritt auf, wenn sich die Sequenzen in der Anzahl der Basen unterscheiden. Eine Sequenz- oder Punktheteroplasmie liegt vor, wenn die Basensequenzen an einer Position differieren.
Vor allem aufgrund zu wenig sensitiver Detektionsmethoden wurde die Häufigkeit von Sequenzheteroplasmie bisher unterschätzt. Es besteht Unsicherheit bezüglich der Erkennung und der Bewertung von Heteroplasmie in der forensischen Fallarbeit. Darüber hinaus ist es bisher ungeklärt, welchen Einfluss unterschiedliche Faktoren wie z.B. der Sequenzkontext, die Lage innerhalb des Amplifikats und bezüglich des Sequenzierungsprimers auf die Detektion und Darstellung von Punktheteroplasmie haben. Auch besteht Unsicherheit darüber, inwieweit die in vivo Situation von der herkömmlichen Analysemethode, der direkten Sequenzierung mitochondrialer Amplifikate, widergespiegelt wird.
Um die Abbildegenauigkeit der direkten Sequenzierung zu prüfen, wurden bereits in Zusammenarbeit mit dem Institut für Gerichtliche Medizin in Innsbruck artifiziell hergestellte Punktheteroplasmien getestet. Hierbei zeigten sich zum Teil starke Schwankungen in der Abbildegenauigkeit.
Im Vergleich soll diese Versuchsreihe mittels Pyrosequencing untersucht werden.

Das Pyrosequencing ist eine alternative Methode zur Genotypisierung und zur Sequenzierung kurzer DNA-Abschnitte. Im Unterschied zu der Kettenabbruch-Methode nach Sanger, auf der auch das häufig in der Rechtsmedizin genutzte „Cycle Sequencing“ mit den Big Dye Terminator-Kits von ABI beruht, wird beim Pyrosequencing der Einbau der Nukleotide in Echtzeit verfolgt. Die eingebauten Nukleotide werden über ein Lichtsignal detektiert, das durch das beim Einbau der Nukleotide freiwerdende Pyrophosphat erzeugt wird.
Ähnlich wie bei den herkömmlichen Sequenzierungsmethoden lässt sich mithilfe des Pyrosequencing eine qualitative Analyse durchführen, d.h. die Nukleotidabfolge kurzer DNA-Abschnitte bzw. die jeweiligen Allele von SNPs (= single nucleotid polymorphisms) lassen sich darstellen. Darüber hinaus ist eine quantitative Analyse mit Hilfe der Herstellersoftware möglich.
Die Quantifizierung spielt vor allem bei Methylierungsanalysen eine große Rolle. Hierbei können in den untersuchten Geweben Mischungen an den einzelnen Positionen in bezug auf den Methylierungsstatus analysiert und Anteile von 5 % bis 10% detektiert werden (Tost et al. 2003). Ähnliche Sensitivitäten werden auch festgestellt, wenn DNA-Mischungen mehrerer Proben („DNA pools“) (Rossmann et al. 2007), Mischungen verschiedener mRNA-Transkripte (Sun et al. 2005) oder im forensischen Kontext Mischspuren (Andréasson et al. 2006) untersucht werden.
In Bezug auf das vorliegende Projekt ist vor allem die Arbeit von Andréasson et al. (2006) interessant, da dabei Mischungen von mitochondrialer DNA mithilfe des Pyrosequencings untersucht wurden. In künstlichen Mischungen konnte der Anteil der geringeren Komponente bis zu 10 % verlässlich detektiert werden. Da für das vorliegende Projekt ähnliche Sensitivitäten gefordert werden, sollen die oben beschriebenen Proben mit Punktheteroplasmien mit der Methode des Pyrosequencings untersucht werden.