FP 3

 

Mit der vollständigen Entschlüsselung des menschlichen Genoms verlagert sich der Schwerpunkt der lebenswissenschaftlichen Forschung von der Analyse der Gene wieder auf die Untersuchung der Genprodukte, der Proteine. Dabei sind bildgebende Verfahren zur Untersuchung von biomolekularen Funktionsprozessen von großer Bedeutung. Traditionelle Methoden der Analyse innerhalb der Zelle bedienen sich der Anfärbung der Zielproteine durch fluoreszenzmarkierte Antikörper. Allerdings müssen dazu die Zellen zunächst fixiert werden und die Proteine in einem aufwendigen Verfahren angefärbt werden.
Als revolutionäre Alternative zu diesen Verfahren entpuppte sich das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der Hydromeduse Aequorea victoria (Abb 1).


Abb. 1: Aequorea victoria

Das fluoreszierende Farbstoffmolekül bildet sich im Inneren dieses Proteins in einer autokatalytischen Reaktion aus drei Aminosäuren; mit Ausnahme von molekularem Sauerstoff werden dafür keine weiteren Enzyme oder Kofaktoren benötigt (Abb. 2).

Abb. 2: Die räumliche Struktur von Aequorea victoria

 

Da die Fluoreszenz des Farbstoffes somit genetisch verschlüsselt ist, kann die kodierende DNA in beliebige Zellen eingebracht werden. Diese stellen dann das Genprodukt GFP her, so dass die Zellen bei Bestrahlung mit blauem Licht grün aufleuchten. Durch geeignete biotechnologische Manipulationen können auch Fusionen von GFP und einem Protein von Interesse hergestellt werden. Hierzu werden die Gene beider Proteine kombiniert. Erfolgt nun die Expression dieses künstlichen Gens, so wird an das zu untersuchende Protein automatisch eine GFP-Domäne angehängt. Dieses leuchtende Tandem kann unter dem Fluoreszenzmikroskop in der lebenden Zelle zeitaufgelöst verfolgt werden (Abb. 3).

Abb. 3: Tubulin-EGFP in lebenden HeLa Zellen

In Zusammenarbeit mit Prof. Gerd-Ulrich Nienhaus (KIT, Karlsruhe) und PD Dr. Jörg Wiedenmann (NOC, Southampton, UK) testen wir die Anwendbarkeit neuer fluoreszierender Proteine (FPs) in der zellbiologischen und entwicklungsbiologischen Forschung.

 

PD Dr. Jörg Wiedenmann - jw1w07@noc.soton.ac.uk

 

Die cDNAs neuer FPs werden aus fluoreszierenden Blumentieren (Abb. 4) gewonnen, in geeignete Vektoren kloniert und zunächst bakteriell exprimiert. Die so aufgereinigten Proteine (Abb. 5) werden dann biophysikalisch analysiert.

Abb. 4: Manche Steinkorallen beinhalten Proteine aus der GFP-Familie: Hier abgebildet ist eine Geweihkoralle (Acropora sp.), die auf einer violetten Porites-Koralle wächst (links). Bestrahlt man die Tierstöcke mit UV-Licht werden die grün fluoreszierenden Proteine sichtbar (rechts).

Abb. 5: Neue fluoreszierende Proteine (FPs) der Arbeitsgruppe Wiedenmann: Die cDNAs der verschiedenen FPs wurden aus fluoreszierenden Blumentieren gewonnen, in entsprechende Vektoren kloniert und bakteriell exprimiert.

Nach Umklonierung der cDNAs in eukaryontische Expressionsvektoren werden zelluläre Anwendungsmöglichkeiten der neuen FPs untersucht.
Dazu werden verschiedene FP-Fusionskonstrukte hergestellt und in Zellen transfiziert. Durch Fluoreszenzmikroskopie wird daraufhin die korrekte Lokalisation der Fusionsproteine analysiert (Abb. 6 und 7). In biochemischen und funktionellen Assays wird zusätzlich getestet, ob die biologische Funktion des Fusionsproteins erhalten bleibt. Neben dem rot fluoreszierenden Protein IhFP611 verwenden wir das von grün nach rot fotokonvertierbare EosFP.

Abb. 6: Eine transient transfizierte HeLa Zelle exprimiert Notch-1-IC-GFP zusammen mit mito-FP611: Notch-1-IC-GFP (grün) ist im Zellkern lokalisiert, die Fusion von IhFP611 mit einem mitochondrialen Lokalisations-Signal bewirkt die spezifische Anfärbung der Mitochondrien (rot).

 

Abb. 7: Transient transfizierte HeLa Zellen exprimieren Tubulin-GFP zusammen mit mito-FP611: Tubulin-GFP (grün) zeigt die für Tubulin typische Lokalisation in einer Interphase Zelle, die Fusion von IhFP611 mit einem mitochondrialen Lokalisations-Signal bewirkt die spezifische Anfärbung der Mitochondrien (rot).

 

Wenn EosFP von der Zelle hergestellt wird, fluoresziert es grün, ähnlich wie GFP. Nach kurzer Bestrahlung mit (ultra-)violettem Licht (390 ± 30 nm) schaltet das Emissionsmaximum von 516 nm (grün) nach 581 nm (rot) um. Aufgrund dieser Eigenschaft wurde das Protein auf den Namen „EosFP“ getauft, nach Eos, der griechischen Göttin der Morgenröte. Bei EosFP geht die Umwandlung des grünen Fluorophors in die rote Form mit einer Photodissoziation des Peptidrückgrats des Proteins einher und ist daher irreversibel. Die steuerbare Farbkonversion des neuartigen Markers ist vor allem in Untersuchungen der zellulären Proteinbewegung von großem Nutzen. Mit EosFP ist es möglich, dynamische Prozesse auch bei einer gleichmäßen Verteilung der Proteine zu beobachten. Hierzu wird innerhalb der Zelle mit einer stark fokussierten Lichtquelle ein kleiner Anteil des Markers von der grünen in die rot fluoreszierende Form umgewandelt. Anhand der Rotfluoreszenz können lokal markierte Proteine oder Zellorganellen von der grün fluoreszierenden Restpopulation unterschieden und somit ihre Dynamik in lebenden Zellen untersucht werden (Abb. 8 und 9).

Abb. 8: Subzelluläre Photokonversion eines EosFP-Fusionsproteins in einer lebenden HeLa Zelle: Im Durchlicht (links) die Form der HeLa Zelle deutlich zu erkennen. Die Fluoreszenzaufnahme (rechts) zeigt die nukleäre Lokalisation eines EosFP-Fusionsproteins (XBP-1-EosFP, grün). Zusätzlich wurde durch eine kurze, lokale Bestrahlung mit 400 nm das Fusionsprotein subnukleär fotokonvertiert (rot)

 

Abb. 9: Subzelluläre Photokonversion von Mitochondrien in einer lebenden HeLa Zelle: Die Zelle exrimiert ein mitochondrial lokalisiertes EosFP Protein Durch eine kurze, lokale Bestrahlung mit 400 nm können die Mitochondrien gezielt photokonvertiert und die Dynamik ihrerer Bewegungen dokumentiert werden.

 

Auch ist es möglich, das Schicksal einer einzelnen Zelle oder einer kleinen Zellgruppe im Rahmen der embryonalen Differenzierung zu verfolgen ("cell fate mapping") (Abb. 10).

Abb. 10: "Cell fate mapping" Experiment während der Embryonalentwicklung des Krallenfrosches Xenopus laevis durch lokale Fotokonversion von EosFP: Im Zweizell-Stadium wurde die mRNA für EosFP in beide Zellen injiziert. Im frühen Gastrula-Stadium (oben links) wird die grün fluoreszierende Form von EosFP im ganzen Embryo exprimiert. Im Bereich des Spemann Organisators wurde eine Zellgruppe lokal fotokonvertiert (rot). Die konvertierte Zellgruppe streckt sich während der Gastrulation entlang der Körperachse (oben rechts). Die konvertierten Zellen verschwinden im Lauf der Neurulation während sich das Neuralrohr schließt (unten links). Das fotokonvertierte Gewebe läßt sich jedoch in späteren Entwicklungsstadien in tiefer liegenden Schichten wiederfinden (unten rechts).

 

Die klassischen Methoden der Lichtmikroskopie besitzen eine zu geringe Auflösung, um biologische Vorgänge auf der Ebene einzelner Moleküle in lebenden Zellen zu beobachten. Ernst Abbe (1873) zeigte in seinen Arbeiten, dass zwei Punkte, die weniger als ~200 nm von einander entfernt sind, aufgrund der Wellennatur des Lichts nicht mehr getrennt sichtbar gemacht werden. Diese Auflösungsgrenze galt seither als nicht überwindbar. Da die viele zelluläre Strukturen eine sehr viel geringere Größe als 200 nm haben, konnten sie bisher mit Hilfe des „konventionellen“ Lichtmikroskops nicht analysiert werden. In den letzten Jahren wurden spezielle Mikroskopiemethoden entwickelt, die es erlauben, diese Barriere zu durchbrechen. Mikroskope, die Bilder jenseits der 200 nm Auflösungsgrenze liefern, benötigen spezielle Fluoreszenzfarbstoffe, die sich gezielt mit Laserlicht an- und ausschalten lassen. Werden diese An- und Ausschaltvorgänge zeitlich so abgestimmt, dass zur gleichen Zeit immer nur Farbstoffmoleküle fluoreszieren, die weiter als 200 nm voneinander entfernt sind, können die einzelnen Farbstoffmoleküle als Lichtpunkte registriert werden. Mit Hilfe von Computer-Algorithmen wird dann die genaue Lokalisation der „Lichtquelle“ berechnet. Nach einer Vielzahl von Schaltzyklen können dann aus den einzelnen Punkten Bilder rekonstruiert werden, deren Auflösung weit unterhalb von 200 nm liegen. Wie gut diese als „Photoactivated Localization Microscopy“ (PALM) bezeichnete Methode funktioniert, hängt stark von der Qualität der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe ab. In einer Zusammenarbeit mit Ulrich Nienhaus (Karlsruher Institut für Technologie) und Jörg Wiedenmann (National Oceanography Centre Southampton, UK) haben wir ein fluoreszierendes Protein entwickelt (mIrisFP), das erstmals eine Analyse dynamischer Vorgänge in optischer Höchstauflösung ermöglicht: Die Fluoreszenzfarbe des als „mIrisFP“ bezeichneten Proteins lässt sich durch Bestrahlung mit Laserlicht von grün nach rot umschalten. Darüber hinaus kann sowohl die grüne als auch die rote Form gezielt ein und ausgeschaltet werden. Durch diese Eigenschaften ist es nun möglich Proteinwanderungen in der lebenden Zelle in optischer Höchstauflösung zu beobachten (Abb. 11).




Abb. 11: Untersuchung von molekularen Umbauvorgängen an den fokalen Kontakt-punkten einer menschlichen Krebszelle.
Oben: Die DNA Sequenz für mIrisFP wurde durch molekularbiologische Methoden mit der kodierenden Sequenz für Paxillin verbunden und in eine menschliche Krebszelle eingebracht. Das daraufhin produzierte mIrisFP-Paxillin Fusionsprotein wird von der Zelle in die so genannten „Fokalen Kontaktpunkte“ transportiert. Durch klassische Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) können diese für die Zellwanderung essentiellen Strukturen sichtbar gemacht werden (links). Die Analyse auf molekularer Ebene ist jedoch durch die begrenzte Auflösung nicht möglich (Ausschnitt, rechts oben). Die optische Höchstauflösung (PALM) erlaubt es jetzt Strukturen weit unterhalb der Auflösungsgrenze zu analysieren (Ausschnitt, rechts unten). Unten: Durch die einzigartigen, multi-funktionellen Eigenschaften von mIrisFP, Fotokonvertierbarkeit und Schaltbarkeit in zwei verschiedenen Farbspektren, ist es nun erstmals möglich, in einer lebenden Krebszelle Proteinbewegungen- hier: das Wachstum von spezifischen fokalen Kontaktpunkten- auf der Ebene von einzelnen Molekülen zu analysieren.

Cover Artwork: