Von dem in Paraffin eingebetteten Tumorgewebe werden histologische Schnitte angefertigt.

An einem Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitt zeichnet der Pathologe die Tumorareale an, um im Schnitt enthaltenes Normalgewebe bei der anschließenden Tumor DNA Extraktion zu minimieren. Hierzu werden je nach Größe des Tumorareals ein bis drei Schnitte entparaffiniert, die Anzeichnung  auf den jeweiligen Schnitt übertragen und die DNA aus dem dissektionierten Tumorgewebe isoliert.

Abhängig von anschließender Analyse wird der DNA-Extrakt von begleitenden Proteinen, Salzen etc. befreit und die DNA Konzentration photometrisch bestimmt.

Zum Nachweis einer Mutation in einem bestimmten Gen wird der interessierende Gen-Abschnitt  aus der DNA mittels einer sog. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt. In einer anschließenden Sequenzierreaktion bestimmt man die Basenabfolge des PCR-Produkts, und im Vergleich mit der bekannten Wildtyp-Sequenz kann eine vorhandene Mutation erkannt werden.

k-Ras ist ein Proto-Onkogen, das für ein so genanntes kleines G-Protein  codiert und als  zentrales „Schalter“-Protein verschiedene Signaltransduktionswege für zelluläre Wachstums- und Differenzierungsprognose reguliert. Es wurden in 20 bis 30 Prozent aller menschlichen Tumoren Punktmutationen im ras-Gen gefunden, die zu einer Akkumulation von aktivem Ras und damit zu einem permanenten wachsstumsstimulierenden Signal in der Zelle führen.

Die Bestimmung des k-RAS Mutationsstatus in den Tumoren hat damit eine zentrale Bedeutung für das therapeutische Vorgehen in der Tumorbehandlung.

b-Raf proto-Onkogen ist eine den k-RAS regulierenden Signalweg nachgeschaltete Serine/Threonine-Protein Kinase. In ca. 10% der Fälle mit dem k-RAS Wildtyp-Gen wurde eine b-RAF V600E Mutation gefunden, die wie bei Patienten mit mutiertem k-RAS einen schwachen Response auf eine anit-EGFR Therapie zeigte.

Analysenmethode : PYRO-Sequenzierung

Die Janus Kinase 2 (JAK2) spielt eine wichtige regulatorische Rolle bei der Zytokin induzierten Signaltransduktion in der Zelle. Die V617F-Punktmutation bewirkt eine konstituive Aktivität der Kinase und stellt einen wichtigen neuen Marker für die Diagnose der chronisch-myeloproliferativen Erkrankungen dar.

Analysenmethode : PYRO-Sequenzierung

Der Epidermal-Growth-Factor-Receptor (EGFR) ist ein Transmembranprotein, dessen  Aktivierung durch die Bindung von Zytokinen an die extrazelluläre Domaine des Rezeptors erfolgt. Das Signal wird über Autophosphorylierung und die Rekrutierung von einer Kaskade von Signalmolekülen unter der Beteiligung von k-RAS und b-RAF ins Zellinnere geleitet, was letztendlich das Zellwachstum stimuliert und den apoptotischen (programmierten) Zelltod verhindert. Der EGF-Rezeptor ist in verschiedenen Tumoren hochreguliert und/oder durch Mutationen ohne eine Zytokinstimulation  aktiv, so dass die Tumorzellen unkontrolliert proliferieren. Neuartige Krebstherapien zielen darauf ab, dieses onkogene Signal von EGFR zu blockieren und somit das Tumorwachstum zu unterbinden.

Analysenmethode: Sequenzierung nach Sanger

c-Kit ist ein die Zellmembran durchspannendes Rezeptorprotein, dessen intrazellulärer Teil  eine zweiteilige Kinasedomäne enthält, die für die Signaltransduktion verantwortlich ist. Als Rezeptorprotein kann c-Kit durch seinen Liganden, den Stammzellfaktor (SCF), aktiviert werden und dadurch entscheidend bei der Proliferation und Differenzierung von Stammzellen mitwirken. Der aktivierte Rezeptor dient als Bindungsstelle für weitere Signaltransduktionsmoleküle wie beispielsweise die Kinasen der Src-Familie, die Januskinase JAK2 und die Phosphoinositid-3-Kinasen, welche ihrerseits eine Vielzahl an Signaltransduktionswegen aktivieren können. Ein durch Mutationen dauerhaft aktivierter c-Kit Rezeptor spielt deshalb eine bedeutende Rolle bei der Onkogenese verschiedenster Tumoren.

Analysenmethode: Sequenzierung nach Sanger

Der Platelet derived growth factor Rezeptor-alpha (PDGFRA) ist ein die  Zellmembran durchspannendes Rezeptor-Protein, das normalerweise erst nach Bindung eines spezifischen Wachstumsfaktors aktiviert wird und daraufhin das Signal, das Zellwachstum und Proliferation fördert, an die Zelle vermittelt. Bei bestimmten mutationsbedingten Strukturänderungen dieses Rezeptors kommt es zu deren permanenter Aktivierung auch in Abwesenheit eines Liganden, so dass das Gleichgewicht zwischen Zellwachstum und  Zelltod http://de.wikipedia.org/wiki/Apoptose (Apoptose)  in Richtung des ersteren verschoben wird und ein abnormes Zellwachstum resultiert.

Analysenmethode: Sequenzierung nach Sanger

NPM1 ist ein nukleo-zytoplasmatisches Transport-Protein. Mutationen im NPM1 Gen bewirken eine vorwiegende Lokation des Nucleophosmins im Zytoplasma der Leukämiezelle. Nucleophosmin (NPM1) Mutationen liegen bei ca. 30% der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie vor und sind damit die häufigsten Mutationen in dieser Krankheit. Prognostische Signifikanz: NPM1 Mutationen bei Patienten mit normalem Karyotyp sind mit einer guten Prognose assoziiert, wenn keine FLT3 Mutation vorliegt. Zusammen mit einer FLT3 Mutation verliert die NPM1 Mutation ihre prognostische Signifikanz. Der NPM1+/FLT3 ITD- Genotyp ist ein signifikanter prognostischer Faktor für das Ansprechen auf die Induktionstherapie und das Überleben.

Analysenmethode: Sequenzierung nach Sanger

Die Methylierung von Cytidin-Basen stellt eine der wichtigsten epigenetischen Veränderung der DNA dar. Dabei werden nur solche Cytidine methyliert, die innerhalb von Cytosin-Guanosin-Dinukleotiden lokalisiert sind.

Eine CpG-Methylierung führt dazu, dass Methyl-CpG-erkennende Proteine an solche meCpG-Paare binden. Dies führt zu einer Kondensation des Chromatins, wodurch die Transkription des betroffenen Gens verhindert wird.

CpG-Dinukleotide treten gehäuft, in sog. CpG-Inseln, vor allem in den Promotor Sequenzen der Gene auf, die für deren Regulation zuständig sind. Der Methylierungsgrad solcher CpG-Inseln ist häufig ein Maß für die Aktivität, mit der das zugehörige Gen transkribiert wird.

Die Analyse genomweiter DNA-Methylierung von Tumorzellen hat gezeigt, dass häufig die Gene für sogenannte Tumorsuppressorproteine im Vergleich zu normalen Zellen methyliert sind.

Mittels DNA Methylierung entzieht sich so eine Vielzahl von Tumorentitäten der regulatorischen Funktion von Proteinen, die für die normale Zelle von essentieller Bedeutung sind, z. B. für die  Zellproliferation, -Adhäsion, Apoptose und auch DNA Reparatur.

Gemeinsam mit unseren Kooperationspartnern bei der Varionostic GmbH Ulm, entwickeln wir Assays für die Analyse der Promoter-Methylierung von Tumor relevanten Genen mittels PYRO-Sequenzierung

Promoter-Methylierungs Assays aus DNA von Kryo-Asserviertem  und zum Teil auch Paraffin-Eingebettetem Gewebe sind z.Z. für folgende Gene möglich:

  • CDH1, E-cadherin 1
  • GSTP1, Glutathion S-transferase 1
  • PTEN, Phosphatase und Tensin Homolog
  • MGMT, Methylguanine-DNA-Methyltransferase
  • P16, Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
  • RASSF1, Ras association domai-containing protein 1
  • SOCS1, Suppressor of cytokine signaling 1
Gewebeversand

Zum Dienstleistungsspektrum der Allgemeinen Pathologie gehört unter anderem der Versand von (typischerweise karzinogenem) Gewebematerial in Form von HE-Schnitten, Slides oder Paraffinblöcken.

Auf den folgenden Seiten erfahren Sie mehr darüber, wie der Prozess des Gewebeversands am Institut gestaltet ist und wie Sie Anfragen stellen können.

Allgemeine Informationen
Informationen zum Gewebeversand wie z.B. etwaig anfallende Kosten
Anforderungen, die erfüllt sein müssen, bevor Gewebematerial versendet werden kann.

Spezifikation des Gewebetyps

  • Der Anfordernde muss den Gewebetypen spezifizieren, den er erhalten möchte

Einsatzzweck des Gewebematerials

  • Der Anfordernde muss den Einsatzzweck des Gewebematerials spezifizieren, also Forschung oder Krankenversorgung

Datenschutz

  • Der Anfordernde muss nachweisen, dass er eine Einwilligungserklärung vom Patienten vorliegen hat.

Dienstleistungsspektrum des Instituts

  • Die geplanten Untersuchungen des Gewebematerials dürfen nicht in das Dienstleistungsspektrum des Instituts für Pathologie fallen. Anderenfalls wird der Versand mit dem Hinweis auf die Möglichkeit abgelehnt, das Institut selbst mit der Erbringung dieser Dienstleistung zu beauftragen.
Informationen über die Gewebetypen, die versandt werden können.

Versendet wird Gewebe in folgenden Formen:

  • Paraffinblöcke
  • HE-Schnitte
  • Leerschnitte (auch Slides genannt)

Paraffinblöcke und HE-Schnitte müssen dem Institut zurückgesendet werden, sobald der Einsatzzweck erfüllt wurde.

Einsatzwecke, zu denen Gewebematerial versandt wird.

Aus dem geplanten Einsatzzweck ergeben sich folgende Punkte:
Einsatzzweck Forschung

  • der Versand ist kostenpflichtig
  • Befundkopien werden auf Wunsch hin versandt, sofern der Institutsleiter dem zustimmt.

Einsatzzweck Krankenversorgung

  • der Versand ist kostenfrei
  • Befundkopien werden versandt
Datenschutzrechtliche Punkte, die beim Gewebeversand zu berücksichtigen sind.

Sollte der Anfordernde nicht bereits über eine Einwilligungserklärung des Patienten verfügt, kann hier ein Musterformular heruntergeladen werden, mit Hilfe dessen eine Einwilligungserklärung vom Patienten eingeholt werden kann:

  • Download Musterformular Einwilligungserklärung
Informationen, wann Kosten in welcher Höhe anfallen.

Ist das Gewebematerial für den Einsatzzweck Forschung vorgesehen, erfolgt der Versand gebührenpflichtig. Hierfür berechnet das Institut eine Gebühr von 25,00 Euro pro Fall (vgl. Artikel "Herausgabe von Objektträgern und Blockmaterial" (Ausgabe 4/05 der Verbandszeitschrift pathologie.de des Bundesverbands Deutscher Pathologen e.V.)).

Diese Kosten trägt der Anfordende (= Rechnungsempfänger) und sind auf eines der unten genannten Konten zu überweisen. Mit dem Gewebematerial erhält der Anfordernde in diesem Fall auch eine Rechnung.

Kontoinhaber Universitätsklinikum Ulm Universitätsklinikum Ulm
Bank Sparkasse Ulm Baden-Württembergische Bank Ulm
Bankleitzahl 63050000 60050101
Kontonummer 106478 7439500404
Verwendungszweck wir auf der Rechnung genannt
BIC SOLADES1ULM SOLADEST
IBAN DE16630500000000106478 DE33600501017439500404

 

Ablauf des Gewebeversands - grafisch in einem Diagramm illustriert.

Das folgende Diagramm skizziert den Ablauf des Gewebeversands am Institut für Pathologie.

Ärzte des Universitätsklinikums Ulm können den Sektionsantrag direkt auf der Intranetseite des Institutes für Pathologie herunterladen, am PC ausfüllen und an die Nummer 56384 faxen.

Zur Beantragung einer Sektion von extern, wenden Sie sich bitte telefonisch an die Präparatorin Fr. Riede (Tel: 0731-500-56359).